β-d-glucane en tant qu’adjonctif diagnostique pour les infections fongiques invasives: validation, développement cutané et performance chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë et de syndrome myélodysplasique

Glucatell → -β-d -glucan BG détection assay Associés de Cape Cod a été étudié comme un complément de diagnostic pour les infections fongiques invasives IFI Sur la base des résultats d’une étude préliminaire des sujets candidats et des adultes en bonne santé, un taux sérique de glycémie ⩾ pg Le test a été réalisé avec des échantillons sériques en série provenant de sujets atteints de leucémie myéloïde aiguë ou de syndrome myélodysplasique recevant une prophylaxie antifongique. Au moins un échantillon de sérum était positif pour la glycémie à une médiane de jours avant le diagnostic clinique en% de sujets avec IFI IFI prouvées ou probables: candidose, fusariose, trichosporonose et aspergillose L’absence d’une constatation positive de glycémie avait une valeur prédictive négative de%, et la spécificité du test était de% pour un seul résultat positif et de ⩾% pour ⩾ séquentiel positif résultats Le test de détection du sérum glycémique Glucatell est hautement sensible et spécifique en tant que complément diagnostique pour IFI

Le taux de mortalité des infections fongiques invasives chez les sujets neutropéniques est de% pour les sujets atteints d’infection à Candida et peut approcher le% pour les aspergilloses invasives , fusariose ou trichosporonose Diagnostic précoce d’infection fongique invasive chez les neutropéniques a la capacité d’augmenter la réponse thérapeutique antifongique, mais des tests diagnostiques significatifs se sont avérés insaisissables. La démonstration histopathologique d’organismes dans des spécimens tissulaires ou la croissance d’agents fongiques dans les milieux de culture reste la méthode de référence, mais l’obtention de tels échantillons peut être difficile. les résultats de culture sont positifs seulement en% d’infections invasives à Candida et Fusarium et sont très rarement positifs en cas d’aspergillose invasive Les cultures de liquide de lavage bronchoalvéolaire ou de brossage ne sont positives que pour <% des sujets atteints d'aspergillose pulmonaire invasive. ] Enfin, les résultats positifs des cultures de spécimens provenant de corps non stériles Ces diagnostics peuvent être associés à la colonisation ou à l'infection, et leur distinction peut être difficile. Les tests diagnostiques basés sur la culture peuvent apporter un complément utile à ces approches plus traditionnelles. La détection du BG-galactomannane circulant L'ADN fongique est apparu très prometteur La BG est un composant de la paroi cellulaire d'une grande variété de champignons et peut être détectée par sa capacité à activer le facteur G de la cascade de la coagulation du crabe en fer à cheval. Le facteur G, activant sa sous-unité β de la sérine protéase zymogène Lorsque cette réaction est combinée à l'enzyme de la cascade et au substrat chromogène Boc-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilide, des niveaux de BG aussi bas que pg / mL peuvent être quantifié par spectrophotométrie Les systèmes de dosage pour la détection de ces composants ont été développés: le test de détection de glucane Fungitec-G Seikagaku et Glucatell Associates de Cape Cod Les réactifs diffèrent en ce qu'ils proviennent de différentes espèces de limules: le réactif Fungitec-G est basé sur les enzymes amébocytes de Tachypleus tridentatus [,,], alors que le réactif de Glucatell utilise des enzymes des amibes de Limulus polyphemus Pour le test Fungitec-G, le seuil sérique positif Le niveau de BG est défini comme pg / mL , mais une valeur seuil correspondante pour le test Glucatell n'a pas été déterminée. Dans cette étude, nous avons comparé les capacités relatives des tests Glucatell et Fungitec-G pour détecter différents composés glucaniques. Enfin, nous avons examiné l'utilité du test Glucatell pour le diagnostic d'infections fongiques invasives chez des sujets en cours d'induction. chimiothérapie pour leucémie myéloïde aiguë nouvellement diagnostiquée AML ou syndrome myélodysplasique MDS et qui recevaient prophylaxie antifongique laxis

Matériaux et méthodes

Composés glucidiques oligosaccharides et polysaccharides La réactivité des dosages de Glucatell et de Fungitec-G glucane a été mesurée à l’aide de certains composés glucaniques obtenus comme suit: → degré de polymérisation → dβ-dylanane [dp], – obtenu auprès de Seikagaku; laminarioligosaccharide dp, – a été obtenu auprès de Associates of Cape Cod; le curdlan, la CMC de carboxyméthylcellulose, le sel de sodium de curdlan et le paramylon ont été obtenus auprès de WakoPure Chemical Industries; le ß-glucane de levure de boulangerie, le laminaran Laminaria digitata, les ß-glucan lichenans d’orge, le sel de sodium CM-cellulose, le nigeran, le mannane et le ß-d-xylane ont été obtenus auprès de Sigma; Eisenia bicyclis laminaire a été obtenu auprès de Nacalia Tesque; le schizophyllane a été obtenu auprès de Kaken Chemical; le lentinane a été obtenu auprès d’Ajinomoto; et pachyman et pustulan ont été obtenus de Calbiochem Candida β-glucan était un cadeau de Dr Ohno Tokyo Université de Pharmacie, Tokyo, Japon, et galactan était un don de Dr Y Hashimoto Université Saitama Kits de tests Chaque kit Glucatell contient Glucatell, un → -β – un lysat d’amébocytes de L polyphemus sensible au d-glucane, qui ne réagit pas à l’endotoxine du fait de l’élimination du facteur C et d’un zymogène de sérine protéase activé par une endotoxine; Lysate d’amibocyte de Limulus réactif eau LRW; tampon de reconstitution de pyrosol Tampon Tris-HCl; pH, glucane standard pachyman; et les réactifs d’extraction d’échantillons AM KOH et BM KCl Les kits de test Fungitec-G-Test MK ont été obtenus auprès de Seikagaku. Tous les matériaux de laboratoire ont été certifiés exempts de glucane contaminant par échantillonnage statistique et tests empiriques par Seikagaku Corporation ou Associates of Dosage de Glucane de Cape Cod Des composés de glucane ont été préparés pour peser et dissoudre chaque composé dans LRW ou NaOH N ou NaOH N, pour que le pachyman donne une solution de -mg / ml. Pour préparer les échantillons de sérum, les ul de sérum à tester ont été dilué: par addition de μL de réactif de prétraitement a: mélange de réactifs d’extraction A et B qui inactive les substances sériques interférentes et modifie la conformation du BG en forme d’hélice unique Le mélange résultant est incubé à ° C pendant ⩾ min Avant d’effectuer d’autres tests, 25 échantillons de Pachyman à,,, et pg / mL ont été utilisés pour la courbe standard. Vingt-cinq μL d’échantillons de LRW ont été utilisés. comme réactifs témoins Glucatell a été reconstitué avec des mL de LRW suivis de mL de tampon de reconstitution de pyrosol M Tris HCl; pH, et μL de ce mélange ont été ajoutés à chaque échantillon, étalon ou puits blanc. En utilisant un lecteur de plaque THERMOmax à ° C, le taux de variation de l’absorbance par min AOD / min à nm moins une lecture de fond à nm était enregistré pour min en utilisant le mode de lecture cinétique de l’instrument et le logiciel SOFTmax PRO, version Molecular Devices Corporation, pour le contrôle des instruments, l’acquisition des données et le traitement Tous les échantillons ont été testés en triplicata Une courbe cinétique standard corrélant ΔOD / min par rapport à la concentration en pachymane a été construite. le taux moyen de changement basé sur des réplicats en triple a été calculé, et la concentration de glucane a été interpolée à partir de la courbe cinétique étalon. La reproductibilité interlaboratoire des résultats d’analyse a été montrée comme étant des données non montrées Le Fungitec-G-Test MK a été réalisé de la même manière sauf que le test a été effectué pour des matériaux minClinical Pour la détermination d’un seuil de dosage provisoire, des échantillons de sérum stockés obtenus à partir de nonneu Les sujets tropéniques présentant des hémocultures positives pour les espèces Candida et les signes et symptômes d’infection associés, p. ex. fièvre ou hypotension ont été comparés à des échantillons d’adultes sains. Dans une étude clinique distincte, des échantillons sériques ont été systématiquement obtenus deux fois par semaine. sujets atteints de LMA ou de SMD nouvellement diagnostiqués et subissant une chimiothérapie initiale d’induction Tous ces adultes ont reçu une prophylaxie antifongique en ouvert avec de l’itraconazole ou de la caspofungine par voie intraveineuse en plus de leurs soins standard. ont été évalués en utilisant les critères EORTC / MSG pour le diagnostic des infections fongiques invasives dans les milieux de recherche Tous les échantillons ont été conservés à – ° C jusqu’à la date de l’analyse. un temps indéfini, résistant aussi à de nombreux cycles de congélation-décongélation Tous les tests ont été effectués en aveugle avant que l’information clinique ne soit compilée et analysée, ce qui élimine tout risque de biais. Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel local et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients.

Résultats

Comparaison des dosages de Fungitec-G et de Glucatell Les dosages de Glucatell et de Fungitec-G se sont révélés être spécifiques des polysaccharides composés de séquences de BG ou en contenant. Ils étaient en grande partie non réactifs avec → -β-d-glucane, → -β- Ces résultats sont cohérents avec ceux rapportés par Tanaka et al L’analyse cinétique a montré que le test de Glucatell était moins réactif que le test de Fungitec-G avec le pachyman. données standard non montrées, réduisant la pente de sa courbe standard avec pachyman

Tableau View largeTélécharger la lameComparaison des réactivités de Fungitec-G Seikagaku et Glucatell Associates de Cape Cod tests contre divers polysaccharidesTable View largeTélécharger slideComparaison des réactivités de Fungitec-G Seikagaku et Glucatell Associates de Cape Cod tests contre divers polysaccharidesDétermination du BG cut-off pour le Glucatell essai Les échantillons de sérum obtenus chez les adultes en bonne santé contenaient une concentration moyenne de BG ± écart-type de ± pg / ml, – pg / ml, avec seulement des échantillons de sérum contenant & gt; pg / ml pg / ml et pg / ml; Les échantillons de sérum prélevés chez les sujets candidats contenaient une concentration moyenne de BG ± SD ± pg / mL, -, pg / mL Parmi ces échantillons, la concentration en BG était de ⩾ pg / mL. Ainsi, pg / mL a été choisi comme positif seuil pour le diagnostic de l’infection fongique invasive avec le test Glucatell A cette valeur limite, le test avait une sensibilité de% et une spécificité de% pour les échantillons testés

Figure View largeTélécharger slideSerum glucan chez les sujets atteints de candidémie et les sujets témoins en bonne santéFigure View largeTélécharger les diapositivesSerum glucan chez les sujets présentant une candidémie et des sujets témoins sainsÉvaluation du test Glucatell chez les patients atteints de LAM et MDS Parmi les sujets neutropéniques inscrits, les sujets ont été exclus de l’étude. ils ont refusé de participer, n’avaient pas reçu de prophylaxie antifongique ou de chimiothérapie, ou avaient échantillons de sérum disponibles Les sujets évaluables restants ont fourni une moyenne de spécimens par sujet pendant plusieurs semaines, pour un total de spécimens. Au cours de l’étude, les sujets avaient une infection fongique invasive prouvée, avaient une infection fongique invasive probable et présentaient des champignons fongiques invasifs. En utilisant la valeur limite prédéfinie de pg / mL, tous les sujets ayant des infections fongiques invasives prouvées ou probables avaient un échantillon de sérum testé positif pour la table BG Absence d’un échantillon positif avait une valeur prédictive négative en% BG était positive à une médiane de jours avant le diagnostic clinique jours avant et jours après chez les sujets ayant une infection fongique invasive prouvée ou probable En considérant tous les sujets ayant une infection fongique prouvée, probable ou possible, les résultats du dosage BG étaient positifs en% à une médiane de jours avant le diagnostic clinique intervalle, jours avant à jours après le diagnostic clinique Un exemple de la performance du test est montré dans la figure Une fois qu’un résultat de test positif a été documenté, la tendance habituelle était que les niveaux de glycémie soient de plus en plus élevés et progressivement élevés jusqu’à ce qu’un résultat soit atteint

Tableau View largeTélécharger la lame Corrélation de l’infection fongique invasive avec les niveaux de glycémie → → β-glucane Tableau View largeTélécharger la lame Corrélation de l’infection fongique invasive avec les niveaux de glycémie → → β-glucane

Tableau View largeDownload slideSensibilité, spécificité, valeur prédictive positive PPV, et valeur prédictive négative NPV de la détection de → -β-D-glucan BG chez les sujets atteints d’une infection fongique invasive IFI, par catégorie de certitude diagnostique EORTC-MSG, chez qui – échantillons sériques positifs pour BGTable View largeTélécharger diapositiveSensibilité, spécificité, valeur prédictive positive PPV, et valeur prédictive négative NPV de la détection de → -β-D-glucane BG chez les sujets atteints d’une infection fongique invasive IFI, par catégorie de certitude diagnostique EORTC-MSG, qui ont – des échantillons sériques positif pour BG

Figure Vue largeDownload slide Détection du → -β-d-glucane dans le sérum avant la détection clinique d’une infection fongique invasive Figure Voir grandDownload slide Détection du → -β-d-glucane dans le sérum avant la détection clinique d’une infection fongique invasive La spécificité du test d’infection fongique prouvée ou probable a augmenté de% pour l’échantillon positif à% et% quand et des échantillons de sérum positifs séquentiels, respectivement, ont été nécessaires pour un vrai tableau de résultats positifs positifs De même, la spécificité de l’infection fongique prouvée, probable ou possible % avec augmentation du nombre requis d’échantillons sériques séquentiels positifs Les résultats pour la valeur prédictive positive ont été améliorés de manière similaire en exigeant plusieurs échantillons sériques séquentiels positifs

Discussion

Dans cette étude, nous avons évalué l’utilité d’un nouveau système de détection de BG Glucatell comme adjuvant diagnostique pour une infection fongique invasive. Le test Glucatell a été comparé à un test similaire, et les tests ont été jugés spécifiques pour BG. échantillons de sérum prélevés sur des échantillons de candidémie et de sérum prélevés chez des adultes en bonne santé, le test Glucatell présente une sensibilité de% et une spécificité de% à une valeur seuil de pg / mL. Cette valeur est supérieure à la valeur seuil de pg / mL pour le test Fungitec-G et est le résultat des différences d’affinité / réactivité des réactifs Fungitec-G et Glucatell, qui sont extraits de différents genres de crabe en fer à cheval, au standard pachyman Fungitec-G est plus réactif, mais il est peu probable avoir une signification clinique avec le point de coupure ajustéAvec l’utilisation de la valeur limite de pg / mL, la performance du test de Glucatell a été déterminée dans une étude sur des adultes subissant une chimiothérapie d’induction Bien que la valeur limite de -pg / mL ait été établie dans une population non leucémique, elle semble s’appliquer à cette population, comme en témoignent la sensibilité et la spécificité élevées. Ces patients sont classiquement exposés à un risque élevé d’infection invasive. infections fongiques Tous les sujets ayant une infection fongique invasive prouvée ou probable présentaient un ⩾ échantillon sérique positif pour la plage de glycémie, – pg / mL, et l’absence d’échantillons sériques positifs dans ce groupe de sujets donnait une valeur prédictive négative de%. a été augmenté de% à & gt;% si des échantillons sériques positifs séquentiels étaient nécessaires pour un résultat vrai-positif Il est à noter que tous les patients recevaient une prophylaxie antifongique, donc bien que l’incidence d’infection fongique soit faible, cette intervention n’a pas semblé affecter le performance du test Le taux relativement élevé de cas de candidémie observés dans cette étude peut être lié à l’utilisation de la prophylaxie à l’itraconazole par certains patients Un seul échantillon de sérum positif pour BG a été détecté chez des sujets sans infection fongique invasive connue, et de ces sujets ont eu des échantillons positifs séquentiels Aucun de ces patients n’avait une colonisation fongique documentée. En revanche, des patients sans infection fongique invasive La colonisation urinaire par cathéter n’a pas montré d’augmentation des taux sériques de BG Des réactions faussement positives ont été observées chez certains patients. Parmi ces patients, citons des sujets ayant eu une insuffisance rénale et hémodialysés avec des membranes cellulosiques , sujets traités avec certains immunoglobulines , et spécimens ou sujets exposés à la gaze contenant du glucane ou à des matériaux apparentés Ceci souligne la nécessité de combiner les résultats sérologiques glycémiques avec d’autres signes et symptômes cliniques et modalités diagnostiques, tels que le scanner haute résolution, lors du diagnostic. BG entraîne chez certains patients une pneumonie fongique possible eflecte les limites des critères EORTC / MSG Tout sujet ayant une infiltration pulmonaire symptomatique mais inexpliquée sera noté comme ayant une pneumonie fongique possible, mais de tels processus pulmonaires pourraient également être dus à une pneumonie virale ou bactérienne non diagnostiquée, à une leucémie ou même à une insuffisance cardiaque. les patients avec une infection fongique invasive possible avaient une pneumonie fongique possible, qui, comme discuté ci-dessus, est un syndrome mal défini qui peut comprendre un mélange de plusieurs étiologies. Les résultats cliniques du test Glucatell étaient comparables à ceux qui ont été rapportés avec le Fungitec G essai Dans une série de sujets avec une variété d’infections fongiques, la sensibilité et la spécificité de Fungitec-G étaient respectivement de% et% La probabilité de toute différence clinique significative entre les tests est faible, car la seule différence entre les tests est l’affinité pour les composés de glucane, et qui a été compensée avec la valeur de coupure ajustée I Les infections détectées par le test BG chez nos sujets incluaient la candidose, la fusariose, la trichosporonose et l’aspergillose. La détection de BG peut également détecter des infections fongiques invasives dues à P neumocystis jiroveci, aux espèces d’Acremonium et aux espèces Saccharomyces Cependant, les concentrations de BG La glycémie est généralement absente chez les patients atteints de zygomycose Les effets du traitement antifongique sur les taux de glycémie restent à étudier En conclusion, la présence de taux de glycémie ⩾ pg / mL, détectée par le test de Glucatell, peut être un complément diagnostique utile pour le diagnostic d’une infection fongique invasive, en particulier dans les populations à haut risque. La positivité de ce test, en particulier lorsqu’il est utilisé en série, précède souvent le diagnostic microbiologique ou clinique des champignons fongiques invasifs. infection Ce composant de la paroi cellulaire a l’avantage d’être présent et détectable dans une variété d’infections fongiques

Remerciements

Subvention de Associates of Cape Cod Conflits d’intérêts FS, RJR, PAK et MAF sont employés par Associates of Cape Cod LO-Z et JHR ont reçu des subventions de recherche de la part de Associates of Cape Cod Tous les autres auteurs: No conflict