Génotypes mixtes de la glycoprotéine B du cytomégalovirus chez les patients immunodéprimés

Sur la base de la variation de séquence du gène UL codant la glycoprotéine B gB, le cytomégalovirus humain CMV peut être classé en génotypes gB. Le but de la présente étude était de déterminer la distribution des génotypes du CMV gB et l’effet du type gB sur les résultats cliniques. une cohorte de patients immunocompromis, comprenant à la fois des receveurs de greffe et des non-receveurs La distribution des génotypes gB était la suivante: gB,% de patients; gB,%; gB,%; gB,%; Contrairement aux patients infectés par un seul génotype gB, les patients infectés par plusieurs génotypes gB développaient une progression vers une maladie à CMV, présentaient un taux accru de rejet de greffe, présentaient des charges CMV plus élevées et étaient significativement plus souvent infectés par d’autres herpèsvirus La présence de plusieurs génotypes gB, plutôt que la présence d’un seul génotype gB, pourrait être un facteur critique associé à des manifestations cliniques sévères chez des patients immunodéprimés

Le cytomégalovirus CMV reste une cause importante de morbidité chez les personnes immunodéprimées, en particulier chez les receveurs de greffe, et peut se manifester par une hépatite et une pneumonite ou par un soi-disant « syndrome viral CMV » avec fièvre, leucopénie et thrombocytopénie. Outre les effets directs de l’infection par le CMV, le CMV peut aussi avoir un effet immunomodulateur, ce qui pourrait constituer un facteur de risque important de rejet d’allogreffes aiguës et chroniques et de co-infection avec d’autres herpèsvirus tels que le virus Epstein-Barr. Compte tenu de l’importance du CMV chez les patients immunodéprimés, une meilleure compréhension des facteurs qui contribuent à la réactivation de la latence et au développement de la maladie symptomatique du CMV conduira à des méthodes de prévention et de traitement plus efficaces. La virulence des différentes souches de CMV facteur de l’apparition de la maladie associée au CMV Virulence parmi les CMV strai ns pourrait différer en raison de la variation génétique des gènes impliqués dans la pénétration des cellules hôtes, le tropisme tissulaire, ou la réplication CMV glycoprotéine B gB est la glycoprotéine d’enveloppe majeure du CMV, et il est codé par UL CMV gB a été impliqué dans la cellule hôte entrée, la transmission de virus de cellule à cellule, et la fusion des cellules infectées, en plus d’être une cible importante pour les deux réponses immunitaires humorales et cellulaires CMV gB est exprimée comme une molécule précurseur qui est glycosylée, puis clivé au codon pour former un complexe lié au disulfure de gp et gp Une méthode de génotypage CMV a été conçue basée sur la séquence nucléotidique gB, qui code une région variable qui englobe le site de clivage de protéase , démontrant l’existence de différents génotypes gB [ ] De nombreuses études ont tenté de trouver une corrélation entre le génotype gB et l’apparition de la maladie associée au CMV chez les patients immunodéprimés; Cependant, on ignore si certains génotypes gB ou génotypes mixtes gB sont associés à une fréquence accrue de maladie. Dans la présente étude, la distribution des génotypes CMV gB a été déterminée chez des patients immunodéprimés, en particulier chez les patients atteints d’infections mixtes à CMV.

Patients, matériaux et méthodes

Étude de la population et du cadre Soixante-quatre patients adultes subissant une transplantation d’organe rein, les patients; foie, patients; et moelle osseuse, patients et patients immunodéprimés atteints de lymphome ou de leucémie n’ayant pas reçu de transplantation étaient éligibles à l’Hôpital Universitaire de Besançon Ces patients comprenaient une cohorte de patients participant à des études évaluant le test de charge CMV, l’analyse sérologique CMV, CMV gB génotype et résultat clinique Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients et le comité d’éthique local a approuvé l’étude. Conception de l’étude Les patients ont été suivis de manière prospective avec le test de charge CMV Seuls les patients ayant des résultats positifs au CMV ont été inclus dans l’étude. Chez les receveurs de greffe, seuls les patients qui ont reçu une greffe d’un donneur avec un résultat sérologique positif au CMV et qui ont eux-mêmes eu des résultats de tests sérologiques négatifs ont été testés avec le génotype CMV génotype CMV. CMV avant de subir une greffe, c.-à-d. ceux qui étaient séropositifs / receveurs séronégatifs pour le CMV ont reçu une prophylaxie antivirale Le génotypage du CMV gB et l’ADN de charge du CMV ont été extraits des échantillons biologiques, et la PCR a ensuite été réalisée avec l’utilisation des amorces gB- ‘-TAGGTGAACTGCAGCTGN-‘ et gB- ‘-TCTGCAAGGYATCAAGC- ‘, Comme décrit ailleurs Les produits de PCR amplifiés ont été hybrides avec une sonde ADN monocaténaire spécifique de chaque génotype gB CMV et ont été revêtus sur la paroi des puits de la plaque de microtitrage avec une liaison streptavidine-biotine. Gen-Eti-K immunodosage [DEIA]; DiaSorine Les amorces suivantes ont été utilisées: gB-séquence consensus ‘-TGGAAYTSGAACGTTTGGCCAA-‘, gB ‘-AGATGGCTACAATGCAGCTGATGTATCCAAC-‘, gB ‘-GGTCCTGACGTCGTACGAGTGACAATAATAC-‘, gB ‘-CGGGCAATACGACCACTCTGTCGCTTGAAAG-‘, et gB ‘-CTTATGTAACGCATCTAGCTACTATGGACTCGGTA-‘ ADN gB spécifique amplifié. les séquences ont été détectées en utilisant un DEIA, comme spécifié par les instructions du fabricant Gen-Eti-K DEIA; DiaSorin, avec mesure des valeurs d’absorbance avec un photomètre à nm Pour la mesure semi-quantitative de la charge en CMV, la PCR a été réalisée sur l’ADN extrait des échantillons biologiques en utilisant les amorces gB- et gB-, avec détection du fragment amplifié avec une séquence consensus gB -TGGAAYTSGAACGTTTGGCCAA- ‘, avec utilisation du DEIA comme spécifié par les instructions du fabricant Gen-Eti-K DEIA; DiaSorine La quantité de produit de PCR CMV amplifié a été quantifiée de faiblement positive à fortement positive. La PCR CMV quantitative en temps réel a été réalisée sur des échantillons biologiques, selon les instructions du fabricant, en utilisant le ABI Prism Applied Biosystem. mL d’échantillon biologique La limite inférieure de détection était des copies / mL sérodiagnostic de CMV Des échantillons de sérum ont été évalués pour les anticorps IgG, IgM et IgA anti-CMV avec l’utilisation d’un ELISA Biotest CMV isolement et pp antigénémie L’isolement de CMV a été effectué sur urine, sang, ou échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire selon la méthode décrite par Mazeron et al La détection de CMV pp a été réalisée par immunofluorescence indirecte de leucocytes isolés du sang périphérique obtenus à partir d’EDTA ou de sang périphérique anticoagulé par l’héparine CMV Brite Turbo; IQ Products Détection d’autres infections virales L’isolement d’adénovirus a été réalisé sur des échantillons biologiques selon la méthode décrite par Pham et al La détection du virus BK, virus herpès simplex HSV, et EBV a été réalisée par PCR comme précédemment décrit Analyse statistique Toutes les entrées de la base de données et l’analyse statistique ont été effectuées en utilisant la version du logiciel SPSS; SPSS Les variables catégorielles ont été analysées en utilisant le test exact de χ ou de Fisher. Une analyse de variance A a été utilisée pour comparer la charge de CMV et le nombre moyen d’épisodes de rejet de greffe chez des patients présentant différents génotypes de CMV.

Résultats

Démographie des patients Quatre-vingt-deux patients immunodéprimés avec une infection à CMV, hommes et femmes, ont été inclus dans l’étude. Les caractéristiques démographiques sont montrées dans le tableau L’âge moyen était de plusieurs années Parmi les patients immunodéprimés,% étaient des receveurs de greffe et% des patients immunodéprimés Parmi les receveurs d’une transplantation hépatique, les maladies sous-jacentes comprenaient l’hépatite C chez les patients, l’hépatite B en, la cholangite sclérosante primitive chez les patients recevant une greffe de foie, la cirrhose biliaire primitive chez les patients recevant une greffe de foie. Maladie du foie chez les receveurs de greffe de rein, les maladies sous-jacentes inclus la glomérulonéphrite chez les patients, la néphropathie interstitielle, la maladie polykystique chez, et d’autres maladies Parmi les bénéficiaires de greffe de moelle osseuse, les maladies sous-jacentes inclus leucémie lymphoblastique aiguë Parmi les patients immunodéprimés qui n’ont pas reçu de transplantation, les maladies sous-jacentes incluent le lymphome chez les patients, la leucémie chez les patients et d’autres maladies chez les receveurs de greffe ont été traités avec des patients atteints de leucémie myéloïde chronique. un régime immunosuppresseur, et les patients avec des rejets de greffe ont été traités comme décrit ailleurs

Caractéristiques des données démographiques et cliniques des patients immunocompromis avec infection par le cytomégalovirus infection à CMV Génotype CMG gB dans des échantillons biologiques L’ADN extrait des isolats du CMV a été amplifié avec succès en utilisant la PCR La distribution du génotype CMV gB de les isolats étaient les suivants: gB,% de; gB,%; gB,%; et gB,% table Les échantillons restants [%] avaient une combinaison de ⩾ différents génotypes gB de CMV Vingt et un de ces échantillons avaient des génotypes gB distincts; % étaient gB et gB,% étaient gB et gB,% étaient gB et gB, et% étaient gB et gB Parmi les échantillons restants,% avaient des génotypes distincts gB, gB et gB et% avaient des génotypes distincts gB, gB, gB , et gB Six isolats ont été choisis pour le séquençage pour confirmer les résultats de restriction Les résultats ont confirmé les modèles de restriction des types,,, et Les génotypes ont été trouvés dans plusieurs échantillons biologiques, y compris des échantillons de plasma, sang total, leucocytes, urine et broncho-alvéolaire Tableau des liquides de lavage Contrairement à l’infection par un seul génotype gB, les infections mixtes ont été détectées plus souvent dans les échantillons de sang total [%] que dans les échantillons de plasma [%] P & lt; La détection d’infections mixtes avec ou de génotypes distincts a été observée principalement dans des échantillons de leucocytes purifiés [%] d’échantillons, plutôt que dans des échantillons de plasma, de sang total ou d’urine. Une infection mixte composée de génotypes n’a été observée qu’une seule fois. isolé à partir d’un échantillon de leucocytes purifiés

Tableau View largeDownload slideDistribution du cytomégalovirus CMV glycoprotéine B génotypes gB isolés à partir d’échantillons biologiques obtenus de patients immunodéprimésTable View largeTélécharger slideDistribution de cytomégalovirus CMV glycoprotéine B génotypes gB isolées à partir d’échantillons biologiques prélevés chez des patients immunodéprimésCMV génotype gB et la charge virale CMV charge a été comparée chez les patients Génotypes CMV gB Nous avons mesuré la charge CMV en utilisant des méthodes distinctes – une méthode semi-quantitative et une méthode quantitative basée sur la PCR et le tableau en temps réel. La valeur moyenne de la charge CMV pour chaque génotype était la suivante: gB, copies / ml plage, & lt; – copies / ml; gB, plage de copies / ml, & lt; copies / mL; gB, plage de copies / mL, & lt; -, copies / mL; et gB, copies / mL seulement échantillon P, non significatif Dans l’ensemble, la valeur moyenne de la charge virale maximale pour l’infection génotype gB unique était de copies / mL,

Figure Vue grandDownload slideCytomegalovirus GV glycoprotéine B gB génotype et charge CMV, tel que mesuré par PCR en temps réel, dans des échantillons de plasma obtenus à partir de patients immunodéprimésFigure View largeDownload slideCytomegalovirus CMV glycoprotéine B Génotype gB et charge de CMV, mesurée par PCR en temps réel, dans le plasma échantillons prélevés chez des patients immunodéprimés

Tableau View largeTélécharger slideCytomegalovirus CMV glycoprotéine B génotype gB et charge CMV dans des échantillons de plasma obtenus de patients immunodéprimés Tableau voir grandDownload slideCytomegalovirus CMV glycoprotéine CMV génotype gB et charge CMV dans les échantillons de plasma obtenus à partir de patients immunocompromisCMV gB génotype et manifestations cliniques CMV maladie est survenue en% des patients immunodéprimés Chez les receveurs de greffe, le risque de progression de la maladie à CMV était de% chez les patients atteints de gB, de% chez les patients atteints de gB, de% chez les patients atteints de CMB et de Le risque de progression de la maladie à CMV était donc de% chez les patients infectés par un seul génotype gB, et de% chez les patients avec des infections mixtes. Par conséquent, le risque de progression vers la maladie à CMV était significativement plus élevé chez les patients présentant une infection mixte que chez les patients infecté par un seul génotype gB P & lt;

Tableau View largeTélécharger les caractéristiques cliniques et le cytomegalovirus Génotypes CMV de la glycoprotéine B chez les patients immunodéprimésTable View largeTélécharger les caractéristiques cliniques et cytomégalovirus Génomique CMV glycoprotéine B génotypes gB chez les patients immunodéprimés Réjection de greffe aiguë survenant chez% des patients Les taux de rejet dans chaque groupe CMV gB étaient les suivants: pour gB,% de patients; pour gB,% de patients; pour gB,% de patients; et pour gB,% du patient Ainsi, le taux de rejet aigu du greffon était de% pour les patients infectés avec un seul génotype gB et était de% pour les patients avec un tableau d’infections mixtes Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les taux de rejet du greffon En revanche, le taux de rejet de greffe chez les patients présentant une infection gB mixte était significativement plus élevé que chez les patients infectés par un seul génotype gB P & lt; Chez les patients immunodéprimés qui n’ont pas reçu de greffe, le risque de progression vers une maladie à CMV était de% chez les patients infectés par un seul génotype gB, comparé à% chez les patients présentant des infections mixtes P & lt; Génotype CMV gB et autres infections virales Parmi les patients testés pour le génotype gB, nous avons observé une co-infection par EBV. Parmi les patients co-infectés par EBV et CMV,% ont été infectés par un seul génotype gB et & lt; Parmi les patients immunodéprimés, les co-infections CMV / HSV présentaient des infections mixtes gB avec des génotypes distincts gB, gB et gB chez un patient et gB, gB et gB chez l’autre. Nous avons également détecté soit le virus BK, soit l’adénovirus chez les patients avec table d’infection mixte CMV

TableauVasteTélécharger DiapositiveVariologie clinique et clinique des infections à cytomégalovirus CMV chez les patients immunodéprimésTable View largeTélécharger DiapositiveValeurs cliniques et cliniques des infections à cytomégalovirus CMV mixtes chez les patients immunodéprimésCMV génotype gB et primo-infection / réactivation Peu importe si les patients ont eu une primo-infection ou une réactivation du CMV, nous n’avons pas observer une différence significative dans la distribution de la table des génotypes gB; données non présentées Le taux d’infection gB mixte n’était pas significativement différent chez les patients présentant une infection primaire par le CMV que chez ceux ayant une table de réactivation du CMV

Discussion

Nos résultats montrent que, contrairement à l’infection par un seul génotype gB CMV, l’infection par plusieurs génotypes gB chez des patients immunodéprimés est associée à une charge virale plus élevée, à une prévalence plus élevée de CMV et à un taux plus élevé de rejet de greffe. En accord avec les rapports précédents [,,], nous avons trouvé que l’infection par le CMV avec les génotypes gB, gB et gB était relativement commune et se produisait dans des proportions similaires%,%, et % des sujets, respectivement, et que l’infection par le génotype gB était rare chez% des sujets Bien que certaines de ces études aient trouvé une plus grande prédominance du génotype gB, les différences dans les fréquences génotypiques peuvent être en partie dues à la variation géographique. distribution des génotypes CMV En accord avec les rapports précédents , nous n’avons pas observé de différence significative entre les génotypes gB en ce qui concerne développement d’une maladie symptomatique, rejet de greffe aigu ou charge de CMV D’autres études récentes chez des receveurs de transplantation rénale ou hépatique n’ont pas observé de corrélation significative entre les différents génotypes gB et le rejet aigu de greffe Par contre, d’autres groupes d’hôtes immunodéprimés ont montré des résultats plus contradictoires , et une étude de Rosen et al sur des transplantés hépatiques a montré que l’infection par le génotype gB était corrélée à un nombre moyen plus élevé d’épisodes aigus de rejet de greffe, sans corrélation avec la sévérité du rejet. Le rejet chronique de greffe a été observé Nous avons observé que l’infection par des génotypes mixtes n’était pas rare. Une analyse prospective des génotypes du CMV gB chez des receveurs de greffe rénale a montré que jusqu’à% des patients étaient infectés par & gt; Génotype gB pendant le suivi Une étude de Sarcinella et al indique que les receveurs de greffe de foie infectés par plusieurs génotypes CMV gB ont développé une progression vers une maladie à CMV En accord avec cette dernière observation, nos données indiquent que parmi les patients avec infection mixte ,% ont développé une maladie à CMV P & lt; , vs infection par un seul génotype gB Il est intéressant de noter que les patients infectés par plusieurs génotypes semblaient être plus fortement immunodéprimés que les autres patients de la cohorte, en particulier du fait du traitement par les globulines antilymphocytaires, ce qui suggère un rôle potentiel Récemment, une étude portant sur des transplantés d’organes solides atteints d’une maladie à CMV et une forte prévalence d’infections à génotypes multiples ont montré que le génotype CMV gB n’influençait pas de manière significative la cinétique ou la réponse au traitement Selon les résultats de notre étude, des tests de routine pour des génotypes multiples doivent être effectués et un traitement préventif indiqué si plusieurs génotypes sont détectés L’immunoréactivation de l’EBV due à une infection à CMV a été rapportée chez des patients recevant un traitement immunosuppresseur après transplantation d’organe. -] En accord avec ces données, nous avons observé une forte h prévalence de la co-infection EBV / CMV et, dans une moindre mesure, de co-infection HSV / CMV chez des patients immunodéprimés infectés par plusieurs génotypes gB Un taux élevé d’immunosuppression pourrait expliquer l’apparition d’un taux plus élevé d’infection par plusieurs génotypes gB de CMV et Infection à herpesvirus Des études antérieures chez des patients immunodéprimés ont montré que la prévalence des génotypes gB différait si les échantillons provenaient de différents tissus Nos résultats indiquent la présence de tous les génotypes gB dans les leucocytes isolés du patient. Dans les leucocytes purifiés mais pas dans les échantillons de sang total ou de plasma, nous émettons l’hypothèse que les leucocytes pourraient permettre un passage d’un génotype à un autre pendant la progression de la maladie. fournir la preuve que, chez les patients immunodéprimés, une manifesta ns surviennent surtout chez les patients infectés par plusieurs génotypes CMV gB D’autres études seront nécessaires pour préciser le rôle exact des génotypes CMV gB dans la virulence et le tropisme tissulaire et pourraient finalement mettre en lumière la pertinence de la gB pour le développement de la maladie associée au CMV

Remerciements

Nous remercions A Vacheret pour son assistance techniqueSupport financier DiaSorin fourni réactifs Conflit d’intérêt Tous les auteurs: Pas de conflit