NH-1,2,3-Triazole Inhibitors of the VIM-2 Metallo- β -Lactamase

Metallo – β -lactamases (MBL) sont une classe émergente d’enzymes avec la capacité de dégrader la plupart des agents antibactériens.1 En raison de la hausse des taux d’infections attribuées Les enzymes de cette classe représentent de nouvelles cibles pour la thérapie antibactérienne adjuvante.2,3 L’enzyme VIM-2 est actuellement la MBL la plus répandue dans les isolats cliniques dans le monde entier, et en tant que telle, la petite molécule les inhibiteurs de cette enzyme peuvent s’avérer utiles dans le traitement des infections résistantes. Plusieurs inhibiteurs de la MBL ont été rapportés, 7,8 avec l’inhibiteur VIM-2 le plus puissant, un dérivé de l’acide 3-mercaptopropionique, présentant un Ki de 190 nM.9 Cependant, à part l’acide p-chloromercuribenzoïque (pCMB), une cystéine non spécifique réactif réactif, aucun inhibiteur de VIM-2 n’a été montré pour potentialiser les effets antibactériens des β -lactames dans les bactéries exprimant VIM-2. 10 Nous avons récemment identifié une famille de NH-1,2,3 4,5-disubstituée -triazoles (figure ​ (figure1) 1) d’inhibiteurs sélectifs de VIM-2 à travers le criblage biochimique d’une banque de NH-1,2,3-triazole ciblée avec 267 membres.10 Figure 14,5-Disubstitué NH-1, Les 2,3-triazoles avec des substituants sur le méthyle en C-4 du triazole (R1) ou l’arylsulfonamide (R2). Le candidat 1 est présenté. Le candidat le plus puissant de cette étude, composé 1, N – ((4 – ((but-3-ynyloxy) méthyl) -1H-1,2,3-triazol-5-yl) méthyl) – Le 4-iodo-benzènesulfonamide présente une activité submicromolaire Ki = 0,41 ± 0,03 μ M contre VIM-2 tout en étant inactif vers la MBL, IMP-1.10 Malheureusement, ce composé n’a pas potentialisé les effets antibactériens d’un antibiotique, l’imipénème. Nous décrivons nos efforts pour examiner la structure et les relations d’activité (SAR) de ce chémotype dans le but d’améliorer la puissance du composé principal 1 et d’identifier les inhibiteurs de VIM-2 avec la capacité de potentialiser les antibactériens de type # 1 003 b 2 -lactame. Dans notre étude, les substituants sur le méthyle C-4 du triazole (R1) ou de l’arylsulfonamide (R2) ont été systématiquement modifiés. Des sulfonamides contenant du NH-triazole ont été facilement préparés comme le montre la figure ​ La réaction clé était la réaction en cascade de propargylazides de Banert avec divers nucléophiles11. La séquence a commencé avec la synthèse de dérivés de N- (4-chlorobut-2-ynyl) -sulfonamide (b) obtenus à partir de propargylamines (a) et de chlorures de sulfonyle. sous les conditions de Schotten − Baumann. La substitution nucléophile du chlorure avec l’azoture de sodium a donné les propargylazides désirés (c), qui, après chauffage, ont subi un réarrangement facile à triazafulvenes (d), intermédiaires hautement réactifs qui pourraient être facilement capturés avec différents nucléophiles.Figure 2Synthèse des composés candidats. De notre travail initial avec les inhibiteurs de l’arylsulfonyltriazole VIM-2, nous avons noté qu’un substituant alcoxy sur le méthyle C-4 de la fraction triazole était important pour l’activité.10 Nous supposons que l’oxygène du groupe alcoxy, un accepteur de liaison hydrogène, est important pour l’inhibition efficace de VIM-2, éventuellement par des interactions polaires entre cet atome et les résidus d’acides aminés du site actif. En conséquence, pour étendre le SAR autour de l’inhibiteur VIM-2 1, cinq nouveaux analogues portant un appendice alcoxy sur le méthyle en C-4 du fragment triazole ont été synthétisés (composés 2 et 5 dans le tableau 1) et examiné dans un essai biochimique de nitrocefin10 en utilisant VIM-2 clone à partir d’une souche clinique de Pseudomonas aeruginosa (COL-1).Trois des cinq nouveaux analogues ont présenté une activité améliorée par rapport à l’original, 1.Table 1SAR de triazolylméthyl 4-iodobenzènesulfonamides par rapport au substituant méthyle C-4, pour explorer plus avant les exigences de substitution de la fraction triazole et montrer que VIM -2 l’inhibition n’était pas unique aux analogues contenant un groupe 4-iodobenzène, une série diversifiée de dérivés 4-chlorobenzènesulfonyles ont été préparés et testés (Tableau 2). Des inhibiteurs avec des valeurs IC50 submicromolaires ont été identifiés à partir de ce groupe de candidats (composés 12 − 16); tous contenaient une amine au C-4 méthyle du cycle triazole. En ce qui concerne le SAR, la puissance des 4-chlorobenzènesulfonamides dépend fortement de la nature du substituant méthyl-triazole C-4. Dans cette série, les composés amino hydrophobes (par exemple, 12, IC50 = 0,29 μ M) et les dérivés alcoxy (par exemple, 17, IC50 = 1,1 μ M) étaient d’excellents inhibiteurs, tandis que les dérivés alkylés (c.-à-d. et 28) étaient peu actifs ou inactifs vis-à-vis de VIM-2. Un sulfure 30, qui est l’analogue thioéther de 22, était inactif. Ces résultats confortent notre hypothèse selon laquelle un accepteur de liaison hydrogène du méthyle C-4 du triazole est important pour les interactions de l’inhibiteur, l’azote étant supérieur à l’oxygène. Cependant, en ce qui concerne la liaison et l’inhibition du VIM-2, le soufre ne semble pas être un bon substitut, probablement en raison de sa plus grande taille et de ses propriétés électroniques plus diffuses. Chlorobenzènesulfonamides vis-à-vis du substituant méthyle en C-4 On a également examiné une série d’arylsulfonamides non substitués (tableau 3). De nouveau, la substitution amino sur le méthyle C-4 du triazole conduit aux composés les plus puissants, les dérivés adamantyle (32) et cyclohexyle (33) approchant IC50 = 100 nM. Tableau 3SAR des triazolylméthyl arylsulfonamides par rapport au C-4 Substituant méthyleNext, nous avons examiné l’effet des substituants aromatiques. Les dérivés 4-iodobenzènesulfonyle et 4-chlorobenzènesulfonyle non substitués équivalents (tableau 3) présentaient au plus une différence d’activité de 3 fois, démontrant que les changements à la position para fournissent des améliorations mineures dans la liaison de l’inhibiteur. par le groupement arylsulfonamide, nous avons préparé des analogues avec le même dérivé de triazole mais avec des substituants aromatiques différents (tableau 4). Encore une fois, la substitution aromatique aux halogénures a eu des effets discrets. Par exemple, la puissance de 2, un dérivé de 4-iodobenzènesulfonyle et 36, un dérivé de 2,5-dichlorobenzènesulfonyle, qui partagent tous deux un appendice isopropyle sur le triazole, différait de 2 fois. De manière similaire, 42, un dérivé 4-méthoxybenzènesulfonyle, et 14, un dérivé 4-chlorobenzènesulfonyle, tous deux partageant un appendice dipropylamine sur le triazole, étaient équipotents. En revanche, les dérivés avec des substituants para aromatiques très volumineux (à savoir, 38) étaient faiblement actifs ou inactifs contre VIM-2.Table 4SAR de Triazolylmethyl Arylsulfonamides avec des substituants aromatiques variables Au cours de l’optimisation de plomb de 1, nous avons reconnu que les inhibiteurs les plus puissants contenaient un groupe dichlorobenzène (tableau 5) et un substituant amine sur le groupe méthyle en C-4 du triazole. Le tableau 5 compare l’inhibiteur VIM-2 44 le plus puissant avec d’autres dérivés amino et alcoxy dans la série 2,5-dichlorobenzènesulfonyle. Les composés 44 et 47 ne diffèrent que par le remplacement de l’azote par l’oxygène et démontrent clairement une amélioration de 20 fois de la puissance de l’amino sur le dérivé alcoxy.Tableau 5SAR de triazolylméthyle 2,5-dichlorobenzènesulfonamides par rapport au substituant méthyle en C-4Pour déterminer sélectivité biochimique pour cette classe chimique, tous les composés rapportés ici ont été testés contre une autre classe B1 MBL, IMP-1. Étant donné que VIM-2 et IMP-1 présentent une divergence de séquences considérable dans leurs sites actifs (33% d’identité de séquence globale), les arylsulfonyltriazoles ne devraient pas inhiber les deux enzymes à moins de se comporter par des mécanismes de promiscuité. En effet, tous les 47 composés étaient inactifs contre IMP-1. Les études de désaccoutumance avec 44 (12) suggèrent que cet inhibiteur se lie à VIM-2 dans le même mode que prévu pour le parent, 1, qui est décrit ailleurs10. que les meilleurs inhibiteurs (c’est-à-dire 41 et 44 et 46) présentent des groupes hydrophobes au substituant méthyle en C-4 du triazole. Nos études d’amarrage et de modélisation ont identifié une cavité qui peut accueillir un groupe hydrophobe compact tel que l’adamantyle ou le cyclohexyle.10,12 Conformément aux découvertes SAR, les appendices triazoles plus petits ne peuvent pas profiter pleinement de cette cavité, tandis que les groupes plus grands ou plus étendus que l’adamantyl En ce moment, seul le pCMB, un inhibiteur VIM-2 lentement réversible / irréversible, a montré un effet synergique avec les antibactériens de β -lactame dans les bactéries exprimant VIM-2.Cependant, ce réactif cystéine-réactif est connu pour avoir plusieurs activités hors-cible, ce qui diminue sa valeur pour les études mécanistiques. Pour démontrer la potentialisation par les arylsulfonyltriazoles chez les bactéries, nous avons évalué la capacité de ces composés à affecter la croissance de Escherichia coli parental (BL21) et VIM-2 transformé (BL21 / VIM-2), en présence ou en l’absence d’un carbapénème, imipénème. Par rapport à la souche parentale (BL21), la CMI (concentration minimale inhibitrice) pour l’imipénème a augmenté d’environ 9 fois lorsque les cellules ont été transformées avec le plasmide codant pour VIM-2 (CMI d’imipénème = 0,21 & gt; imipénème MIC = 1,85 μ g / ml dans BL21 / VIM-2). Cette diminution de la puissance antibactérienne reflète la capacité de VIM-2 à dégrader l’imipénème. Lors de l’essai à 50 μ M, 14 des 47 arylsulfonyltriazoles ont potentialisé l’imipénème et par conséquent ont été testés à des doses plus faibles (tableau 6). Le composé 45, avec la meilleure potentialisation, a amélioré la CMI de l’imipénème de 3 fois de 1,85 à 0,617 μ g / ml à 10 μ M (Tableau 6). Pour déterminer si cette classe d’inhibiteur peut potentialiser complètement l’imipénème, le composé 45 a été testé à des concentrations plus élevées. En effet, la CIM pour l’imipénème a été entièrement restaurée à celle observée pour la souche parentale (c’est-à-dire, dépourvue de VIM-2) lorsque 45 a été testée à 150 ° C. De plus, dans les cellules parentales (BL21), la CIM pour l’imipénème n’était pas affectée par la présence de 45 jusqu’à 150 ° C. Il a également été établi qu’aucun de ces 14 composés ne présentait d’activité antibactérienne intrinsèque étant donné que la croissance des cellules de E. coli n’était pas affectée lorsqu’ils étaient testés à 150 μ M.Tableau 6 Résultats des études de potentialisation du Ki et du MIC 2 inhibiteurs actifs à 50 μ M dans E. coli exprimant VIM-2 a été en outre évalué par des études cinétiques (tableau 6). Les meilleurs inhibiteurs présentaient des valeurs de Ki aussi faibles que 10 nM (c’est-à-dire 46), et toutes sauf une présentaient une inhibition compétitive classique et donc se lient au site actif. Seulement 42 présente un mode d’inhibition mixte avec des caractéristiques d’inhibition compétitive et non compétitive. Alors que la cinétique d’inhibition pour 42 est quelque peu différente par rapport aux 13 autres composés, une composante d’inhibition compétitive suggère encore que la liaison de 42 se produit au site actif. En conclusion, la fidélité et la robustesse de la cascade de Banert ont été rapidement assemblées causal. Bibliothèque de NH-1,2,3-triazole provenant de divers réseaux de fragments hautement fonctionnalisés. Les efforts de chimie médicinale ont progressé via trois étapes itératives et ont abouti à la synthèse de 320 composés uniques. Le composé de départ présentait une activité biochimique modérée vis-à-vis de VIM-2 tout en étant inactif vis-à-vis d’IMP-1. La substitution à l’arylsulfonamide a produit des améliorations subtiles dans la puissance. D’autre part, des analogues portant une substitution amino sur le méthyle en C-4 du triazole ont généré des inhibiteurs de VIM-2 très puissants qui potentialisent l’activité antibactérienne de l’imipénème. Les meilleurs inhibiteurs présentent jusqu’à 40 fois plus d’activité dans les dosages biochimiques supérieurs à 1 et représentent les inhibiteurs de VIM-2 les plus puissants à ce jour. En outre, ce sont les premiers inhibiteurs déclarés à être actifs contre VIM-2 dans les bactéries (E. coli), sans effets apparents hors cible.