Shiga Toxine Activable Par Le Mucus Intestinal Chez Escherichia Coli Isolé Des Humains: Prédicteur Pour Un Résultat Clinique Sévère

Contexte Certains Escherichia coli produisent une toxine Shiga dans laquelle la cytotoxicité est activée par le mucus intestinal et l’élastase. Ces souches sont très virulentes chez la souris, mais leur association avec la maladie humaine est mal comprise Nous avons étudié la prévalence de Stxdactivable parmi les E. coli producteurs de Stx. Méthodes Un total d’isolats de STEC obtenus chez des patients atteints de syndrome hémolytique et urémique ou de diarrhée sanglante ou non-sanglante ou de porteurs asymptomatiques ont été testés pour le gène codant pour Stxdactivable par PCR et restriction PstI. analyse L’activabilité de la toxine par le mucus intestinal humain et murin et par une élastase a été déterminée en quantifiant la cytotoxicité en utilisant le test de cellules Vero. Résultats Le gène stxd-activable a été identifié en% de souches STEC; Parmi ces souches, il était le seul gène Stx Trente de ces souches produites Stxdactivatable Tous manquaient du gène eae codant pour l’intimin Parmi les STEC eae-négatives, qui provoquent typiquement une diarrhée légère ou une infection asymptomatique, la production de Stxdactivatable était significativement associée au capacité à provoquer une maladie grave, y compris une diarrhée sanglante P & lt; et avec des complications systémiques, telles que le syndrome hémolytique et urémique P & lt; Conclusions La production de Stxdactivable par le STEC infectant peut prédire un résultat clinique sévère de l’infection, avec progression vers le syndrome hémolytique et urémique. Un sous-typage rapide et complet des gènes stx dans les isolats STEC est nécessaire pour alerter le médecin traitant qu’un patient risque de développer syndrome hémolytique et urémique, même si le STEC infectant manque d’eae

Infection à la toxine Shiga Escherichia coli productrice de Stox STEC peut entraîner un éventail de résultats, allant du portage asymptomatique à la diarrhée non compliquée, à la diarrhée sanglante et au syndrome hémolytique et urémique HUS HUS consiste en anémie hémolytique, thrombocytopénie et insuffisance rénale aiguë [ ,], et c’est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez les enfants Le taux de mortalité associé au SHU pendant la phase aiguë est de% -% , et il y a un taux élevé de séquelles rénales ou non rénales chez les survivants. STEC O: H est la cause prédominante de HUS [,,,,], mais plusieurs sérotypes non-O: H ont émergé [,, -] Stxs sont les principaux facteurs de virulence impliqués dans la pathogenèse du SHU les toxines ont été subdivisées, sur la base des tests de neutralisation des toxines et de l’analyse des séquences des gènes stx, en familles, Stx et Stx Chaque famille est constituée du type Stx majeur et des variants Les membres de la famille Stx sont Stx, Stxc , et Stxd Le Stx plus hétérogène famille comprend Stx, Stxc , Stxc , Stxd , Stxe , et Stxf Le groupe Stxd comprend des toxines et distinctes décrites indépendamment, StxdEH et Stxdactivatable La désignation de cette dernière toxine a été dérivée de sa capacité à être activée dans son activité biologique démontrée comme une augmentation significative de sa cytotoxicité pour les cellules cultivées par la muqueuse intestinale de la souris ou de l’homme Cette activation du mucus différencie Stxdactivatable des autres Stxs actuellement connus L’activateur de Stxdactivatable dans le mucus de souris est une élastase qui est hautement homologue à l’élastase humaine IIIB L’activation implique le clivage par l’élastase des derniers acides aminés C-terminaux d’une sous-unité A enzymatiquement active de Stxdactivatable À la suite de cette activation, STEC qui produisent Stxdactivatable sont considérablement plus virulents dans un modèle de souris traité à la streptomycine de l’infection STEC orale% dose létale [LD] de & lt; unités formant des colonies [cfu] que STEC produisant Stx ou Stxc LD de cfu La virulence accrue de STEC produisant Stxdactivatable dans ce modèle a conduit à l’hypothèse que la présence d’un Stx activable dans STEC infectant les humains et l’activation de cette Stx par le mucus intestinal humain pendant l’infection pourrait entraîner une virulence accrue de ces souches pour les humains Cependant, l’association de STEC qui produisent Stxdactivatable avec la maladie humaine est mal comprise Par conséquent, nous avons étudié la prévalence de E coli qui produisent Stxdactivatable dans une grande collection de STEC provenant de sujets cliniquement bien définis, et nous avons déterminé l’association entre la production de Stxdactivable par le STEC infectant et le résultat clinique de l’infection

Patients et méthodes

Patients et souches Un total de souches STEC ont été isolées à partir d’échantillons de selles provenant de patients isolés épidémiologiquement non apparentés atteints de souches HUS, de souches diarrhéiques sanglantes ou de souches diarrhéiques non sanglantes ou de souches porteuses asymptomatiques, comme décrit ailleurs Les souches appartenaient à sérotypes, déterminés par une méthode de sérotypage par microtitrage Six cent quatre-vingt-trois souches appartenant à des sérotypes contenaient le gène eae codant pour le facteur d’adhérence STEC intimin , et les souches appartenant aux sérotypes étaient des souches séronégatives. BF , qui a été isolé chez un patient atteint de SHU , a été gracieusement fourni par MA Karmali Agence de santé publique du Canada, Guelph, Canada

Vue de la table largeTéléchargementsSerotypes, gènes eae et associations cliniques de souches d’Escherichia coli productrices de shigatoxines étudiées pour stxd-activatableTable ViewTermes à grande échelleSerotypes, gènes eae et associations cliniques de souches d’Escherichia coli productrices de Shiga, étudiées pour la définition de stxd-activatableCase Patients avec Les patients atteints de diarrhée sanglante ont été définis comme des patients ayant des selles liquides par jour dans lesquelles du sang visible a été noté dans les selles. Le HUS a été défini comme un cas d’anémie hémolytique microangiopathique hématocrite de & lt;% avec des signes périphériques d’hémolyse intravasculaire, thrombocytopénie plaquettaire, & lt ;, plaquettes / mm, et insuffisance rénale: concentration sérique en créatinine supérieure à la limite supérieure de la normale pour l’âge Détection ofstxgenes La présence du gène codant pour Stxdactivatable dans les souches STEC ont été testées pour l’utilisation La PCR avec les amorces SLT-II-vc et CKS et l’analyse de restriction de l’amplicon bp de la paire -base résultant avec PstI PstI ne clive pas l’amplicon dérivé de stxd-activable mais clive cet amplicon en fragments -bp et -bp si la cible est stx ou stxc La présence de stx, stxc, stxd, stx, stxc, stxdEH et stxe a été recherchée, comme décrit ailleurs [,,,] Isolement de la muqueuse intestinale de la souris et de l’homme Mucus a été isolé des intestins petits et grands des souris BALB et des effluents regroupés obtenus pendant la coloscopie chez l’homme Les préparations de mucus ont été ajustées à une concentration en protéine de mg / mL avec de l’acide N-hydroxyéthylpipérazine-N ‘- éthanesulfonique HEPES; g / L tampon pH, et ont été congelés en aliquots à – ° CMucus et test d’activation élastase Dans le test d’activation du mucus , les surnageants filtrés stériles ont été préincubés pour h à ° C avec du mucus intestinal souris ou humain mg / mL ou tampon HEPES et testé pour la cytotoxicité en utilisant des cellules Vero Le niveau d’activation a été déterminé comme le rapport entre le titre de cytotoxicité du surnageant traité par le mucus et celui du surnageant traité par HEPES La toxine a été considérée comme activable lorsque le titre de cytotoxicité a au moins après l’incubation avec le mucus intestinal de la souris et au moins multiplié après l’incubation avec le mucus colique humain. Ces valeurs de coupure étaient basées sur les plus bas niveaux d’activation produits par le mucus plissé et humain dans le surnageant du contrôle. Souche BF inactivée productrice Aucune des préparations de mucus n’étaient toxiques pour les cellules Vero à la concentration utilisée. Dans le test d’activation de l’élastase, les surnageants ont été incubés pendant h à ° C une unité d’élastase pancréatique porcine EC; Calbiochem utilisé à la place de l’élastase intestinale de souris, qui n’est pas disponible dans le commerce ou avec un tampon de resuspension phosphaté élastase mM KHPO et mM NaHPO; pH, L’activation a été déterminée comme décrit ci-dessus La toxine a été considérée comme activable lorsque le titre de cytotoxicité a augmenté au moins après incubation avec l’unité de l’élastase. Cette concentration en élastase a été choisie car elle n’est pas toxique pour les cellules Vero. h, et des unités de l’élastase ont provoqué des cytotoxicités dans les titres de: et: Détection d’autres agents pathogènes bactériens entériques dans les selles Espèces de Salmonella, espèces de Shigella, Yersinia enterocolitica et Campylobacter jejuni ont été recherchées en utilisant des procédures standardAnalyse sérologique Anticorps IgM contre le lipopolysaccharide O dans des échantillons de sérum L’analyse statistique a été réalisée en utilisant le test,, le test Y corrigé de Yates, et Epi-Info, version Centers for Disease Control and Prevention et l’Organisation mondiale de la Santé P valeurs & lt; ont été considérés comme significatifs

Résultats

Prévalence de STS activable dans le STEC et caractérisation des souches hébergeant le gène et les patients associés Le gène codant pour Stxdactivable a été identifié dans% d’isolats de STEC étudiés Trente et une de ces souches contenaient stxd-activable comme seul gène stx; les autres souches possédaient stxd-activable en combinaison avec stx et / ou stx table STEC hébergeant stxd-activable appartenait à des sérotypes, dont les plus communs étaient O: H isolats, isolats O: H et O: H isolats tableau Toutes les souches STEC abritant stxd-activable étaient eae négatif Cela a abouti à une prévalence significativement plus élevée de stxd-activable chez les souches STEC [%] eae-négatives que chez STEC eae-positif des souches χ,; P & lt; ; % CI, – Treize des cas de SHU grave ou de diarrhée sanglante associée à un STEC stéroïdable activable se sont produits chez des patients infectés par des souches stxd-activables comme seul stx-table. Ces patients étaient sensiblement plus âgés selon l’âge médian que ceux infectés par des souches hébergeant stxd-activatable en combinaison avec d’autres tables de gènes stx

Les génotypes stx, les sérotypes et les associations cliniques des souches d’Escherichia coli produisant des toxines de Shiga hébergeant stxd-activatableTable View largeTélécharger Les génotypes stx, les sérotypes et les associations cliniques de souches d’Escherichia coli productrices de toxines Shiga hébergeant la cytotoxicité stéro activation de Stx produite par STEC portingstxd-activable par le mucus intestinal et l’élastase Les surnageants de toutes les souches STEC qui hébergeaient stxd-activable comme seul gène stx étaient cytotoxiques à la plage de titrage des cellules Vero, -; titre médian, tableau La préincubation avec le mucus intestinal de la souris a entraîné des augmentations d’un facteur cyt des titres de cytotoxicité dans toutes les plages sauf celles de la souche, -; augmentation médiane, tableau pli Dans ces souches, la cytotoxicité a également augmenté de manière significative après préincubation avec la gamme de mucus colique humain, – pliée; augmentation médiane, -fold and elastase range, – fold; augmentation médiane, tableau pli Un degré d’activation similaire a été observé après incubation avec les préparations de mucus et l’élastase dans la table de la souche productrice Stxdactivable-productrice BF

Vue de la table largeTélécharger slideVéro cytotoxicité cellulaire et Shiga toxine Stx activabilité par le mucus et l’élastase intestinaux murins et humains pour les souches d’Escherichia coli productrices de Stx hébergeant stxd-activable comme seul gène stxTable View largeTélécharger slideVero cytotoxicité cellulaire et Shiga toxine Stx activabilité par la souris et l’intestin humain mucus et élastase pour les souches d’Escherichia coli productrices de Stx hébergeant stxd-activable comme seul gène stxActivation d’autres types Stx par le mucus et l’élastase intestinaux Huit cent soixante-deux souches STEC hébergeaient des gènes codant pour d’autres types Stx, y compris Stx, Stxc, Stxd , Stx, Stxc, StxdEH et Stxe Certains de ces Stx ont été montrés inactivables par le mucus intestinal Pour étudier l’activité de mucus et d’élastase de tous ces types Stx, – des souches choisies au hasard qui ont produit chacun de ces Stxs comme une seule souche Stx a été soumise au test d’activation Aucune n’a montré une augmentation de la cytotoxicité Ainsi, tous ces Stx sont très probablement inactivables. Etant donné que toutes les souches de STEC qui ont produit Stxdactivable ont été négatives, nous avons analysé les résultats de l’étude de l’activation de Stxdactivable. association entre la production de Stxdactivatable et le résultat clinique de l’infection chez les individus infectés par STEC A Une analyse stratifiée incluant les souches STEC qui ont produit Stxdactivatable comme seul Stx a été réalisée pour éviter la confusion par coproduction de Stx Stx et / ou Stx non activables par le autres souches et contribution potentielle de ces Stx au résultat clinique Les STEC ne représentent qu’une faible proportion du nombre total de STEC isolés chez les patients présentant un HUS% et un taux de diarrhée sanglante, mais les STEC produisant Stxdactivable représentent la plupart des patients. souches de STEC négatives isoler Tableau des souches de STEC isolées chez les patients atteints de diarrhée sanglante Parmi les isolats de STEC obtenues chez des patients atteints de diarrhée non sanglante et de porteurs asymptomatiques, chez qui les proportions de souches eae-négatives sont respectivement% et%, les proportions relatives des souches productrices de Stxdactivables parmi les isolats STEC eae-négatifs sont considérablement plus faibles% et%, respectivement Tableau Toutes les souches STEC produisant Stxdactivable ont été isolées chez des sujets qui étaient malades et démontrant que la production de Stxdactivable par le STEC infectieux eae-négatif est significativement associé à sa capacité à provoquer une maladie, par rapport à une infection asymptomatique χ,; P & lt; ; % CI, – tableau Fait intéressant, le seul isolat obtenu d’un individu asymptomatique, qui hébergeait stxd-activable comme seule stx, n’exprimait pas le tableau de phénotype activable Parmi les STEC eae-négatifs isolés des individus symptomatiques, la production de Stxdactivable par la souche infectante était significativement associée à la capacité de provoquer une maladie grave HUS et une diarrhée sanglante, par rapport à une diarrhée non sanglante de maladie bénigne χ,; P & lt; ; % CI, – tableau Parmi les isolats eae-négatifs obtenus chez des patients ayant développé une diarrhée mais pas en SHU, la production de Stxdactivatable était significativement associée à une diarrhée sanglante, comparée à la diarrhée non sanglante χ,; P & lt; ; % CI, – tableau, bien que le nombre d’isolats obtenus chez des patients souffrant de diarrhée sanglante était faible. De plus, la production de Stxdactivable par le STEC infectant eae-negatif était significativement associée à la capacité de provoquer HUS, comparé à d’autres résultats χ; P & lt; ; % CI, – tableau Pris ensemble, cette analyse a démontré que, chez les patients infectés par STEC eae-négatif, la production de Stxdactivable par la souche infectante est un facteur de risque pour un résultat clinique sévère et pour la progression systémique de l’infection à HUS

Tableau View largeTélécharger slideAssociation entre les résultats cliniques de l’infection due aux souches STEC Escherichia coli produisant Stx toxine Shiga-eae et la production de StxdactivatableTable View largeDownload slideAssociation entre les résultats cliniques de l’infection due aux souches STEC Escherichia coli productrices de Shiga toxine La production de StxdactivatableCharacterization des patients infectés par STEC produisant Stxdactivatable L’âge médian des patients à partir desquels les souches de STEC qui ont produit Stxdactivatable ont été isolées était des années range, – years Les âges des patients étaient inconnus Les âges étaient disponibles pour des patients avec HUS; Une personne âgée d’un an était décédée pendant la phase aiguë des tables de SHU et aucun des survivants atteints de SHU pour lesquels on connaissait l’âge O lipopolysaccharide IgM, démontrant que E coli O: H, qui est la cause la plus fréquente de SHU associé à STEC, n’a pas été manqué par l’évaluation microbiologique Des échantillons de sérum des patients restants avec HUS n’étaient pas disponibles les STEC productrices étaient négatives pour les espèces de Salmonella, Shigella, Y enterocolitica et C jejuni

Discussion

maladie grave Notre analyse systématique de l’association entre la production de Stxdactivable par la souche infectante STEC et le résultat de l’infection suggère que la production de Stx activable peut être un facteur de risque de SHU après infection par STEC eae-négatif, qui autrement cause rarement la table HUS [,,] Par son association avec le résultat sévère de l’infection causée par STEC eae-négatif, Stxdactivatable est parallèle à la signification pathogénique de Stx parmi STEC eae-positive [,,] Cependant, contrairement à Stx, qui est associé avec le développement du SHU chez les enfants & lt; [traduction] D’un point de vue pratique, nos données démontrent la nécessité d’un sous-typage rapide et complet des gènes stx dans les isolats de STEC par les microbiologistes et l’interprétation immédiate et la production de rapports. des résultats pour les cliniciens L’information sur la présence du gène codant pour Stxdactivable dans le STEC infectant pourrait alerter le médecin traitant qu’un patient est à risque de développer un SHU, même si cette souche manque d’un tel symptôme. Développement du SHU et augmentation du volume intraveineux , associée à un risque réduit d’insuffisance rénale anurique chez les patients atteints de SHU due à STEC O: H Bien que le risque précis de développer un SHU chez un patient atteint de diarrhée infectée par un Stxdactivatable la production de STEC est inconnue, ces organismes pourraient avoir des conséquences pour les humains infectés similaires à ceux associés à STEC O; Nous croyons qu’il serait approprié de traiter ces patients de manière similaire, au moins jusqu’à ce que plus de données émergent. Parce que le Stx activable a été exprimé par la majorité des isolats de STEC qui contenaient stxd-activable comme seul stx d’isolats, nous proposons que l’identification des le gène lui-même, sans avoir besoin d’effectuer un test d’activation du mucus ou de l’élastase, pourrait être un prédicteur suffisant du potentiel hautement pathogène du STEC isolé. Ces données démontrent également le besoin d’une caractérisation plus étendue, rapide et précise des souches infectantes. , au-delà de la simple évaluation de leur capacité à produire StxLa pathogénicité accrue de STEC hébergeant stxd-activable pour l’homme, comme démontré dans notre étude, a été suspectée sur la base d’isolements occasionnels précédents de telles souches de personnes gravement malades, y compris des patients diarrhée ou SHU [,,] Dans une étude provenant des États-Unis , STEC qui produisait Stxdactivable étaient associés avec une évolution plus sévère de la diarrhée, comme le démontre un taux plus élevé de procédures diagnostiques ou thérapeutiques chez les patients infectés par de telles souches; cependant, l’association avec la diarrhée sanglante n’a pas atteint la signification statistique La virulence apparente disproportionnée de STEC produisant Stxdactivatable pour des humains est également suggérée par leur capacité de provoquer des manifestations, qui sont exceptionnellement associées à STEC eae-négatif De noter, le eae- La souche O: H de STEC négative, qui a provoqué une large flambée de colite hémorragique aux Etats-Unis , produit Stxdactivable Les raisons de la virulence excessive des souches productrices de Stxdactivatable ne sont pas encore comprises, mais elles sont probablement complexes. que la production d’une toxine activable pourrait compenser le manque d’intimine, qui intervient dans l’adhésion intestinale intime des STECs eae-positifs et, ainsi, permet une livraison efficace de Stx de l’intestin à la circulation sanguine Une autre explication plausible être un taux élevé de l’expression de Stxdactivatable dans les souches qui contiennent ce gène, comme observé dans notre étude En contra st, un sous-ensemble de STEC eae-négatif qui hébergent des gènes structurellement intacts codant d’autres variants Stx, par exemple, StxdEH et Stxe ne sécrètent pas Stxs Alternativement, STEC produisant Stxdactivatable pourrait exprimer des facteurs de virulence supplémentaires, mais non identifiés à leur virulence humaine élevée Il convient de noter que la production de Stx activable n’est pas essentielle pour la capacité de STEC à NEE négative à causer HUS Quatre isolats HUS eae-négatifs dans cette table d’étude et un STEC O: H qui a causé Récemment, un vaccin oral à base de plantes pour la protection contre l’intoxication systémique causée par Stx a été développé La capacité de ce vaccin à protéger complètement les souris contre la pathologie rénale et la mort résultante causée par Stxdactivatable La souche productrice BF est prometteuse et pourrait être utile pour prévenir les maladies humaines causées par de telles souches. En résumé, nous avons identifié Stxdactivatable comme une c Utilisation de STEC Les stratégies diagnostiques doivent être modifiées pour identifier les variants alléliques dans les STEC, et les patients symptomatiques doivent être considérés comme présentant un risque accru de séquelles microangiopathiques et traités en conséquence.

Remerciements

Nous remercions Philip I Tarr Université Washington School of Medicine, St Louis, MO, pour des discussions fructueuses, et Dagmar Mense Institut d’Hygiène, Université de Münster, Münster, Allemagne, pour l’assistance techniqueSupport financier Centre Interdisciplinaire de Recherche Clinique IZKF, Münster subvention Ka / / à MBPotentiel conflits d’intérêts Tous les auteurs: pas de conflits